執(zhí)照.jpg)
蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）試劑盒說明書
微量法
正式測定管前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義
蔗糖不僅是重要的光合產(chǎn)物，也是植物體內(nèi)運輸?shù)闹饕镔|(zhì)，還是碳水化合物的貯存形式之一。SPS（EC 2.4.1.14）以果糖-6-磷酸為受體，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑。
測定原理
蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸與間苯二酚反應可呈現(xiàn)顏色變化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色的深淺成正比。
需自備的的儀器和用品
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、離心機、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰
試劑的組成和配制
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 2.5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：1000μg/mL 蔗糖溶液 10mL×1 瓶，4℃保存；
試劑三：液體 2mL×1 瓶，4℃保存
試劑四：液體 25mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：液體 6mL×1 瓶，4℃保存；
樣品測定的準備：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至480nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 10 | 10 |
|
|
蒸餾水 |
| 45 | 45 | 55 |
試劑二 |
|
| 10 |
|
試劑一 | 45 |
|
|
|
混勻，25℃準確水浴 10min | ||||
試劑三 | 15 | 15 | 15 | 15 |
沸水浴中煮沸 10min 左右（蓋緊，以防止水分散失），冷卻 | ||||
試劑四 | 210 | 210 | 210 | 210 |
試劑五 | 60 | 60 | 60 | 60 |
混勻，沸水浴30min，冷卻后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下測定各管吸光值。標準管和空白管只要做一管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。
SPS 活力單位的計算
1、按照蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
SPS 活性(μg /min/mg prot)= {C 標準管×V1×（A 測定管-A 對照管)÷（A 標準管-A 空白管)）÷(V1×Cpr)÷T=100×（A 測定管-A 對照管)÷（A 標準管-A 空白管)÷Cpr
2、按照樣本鮮重計算
單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。
SPS 活性(μg /min/g 鮮重) = {C 標準管×V1×（A 測定管-A 對照管)÷（A 標準管-A 空白管)）÷(W×V1÷V2)÷T=100×（A 測定管-A 對照管)÷（A 標準管-A 空白管)÷W
C 標準管：標準管濃度，1000μg/mL；V1：加入反應體系中樣本體積，0.01mL； V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；T ：反應時間：10min。
實驗代做服務：
|
