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酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。該技術(shù)所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、價(jià)格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定，光吸收高。
一、酶和酶作用的底物
1.辣根過(guò)氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無(wú)色糖蛋白，在275nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，
在403nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰。HRP對(duì)受氫體的專一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過(guò)氧化物和尿素的過(guò)氧化物。后者為固體，作為試劑較H202方便。
許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS.OPD為在ELISA中應(yīng)用zui多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無(wú)此缺點(diǎn)。TMB經(jīng)酶作用后由無(wú)色變藍(lán)色，目測(cè)對(duì)比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見(jiàn)增多。ABTS，雖然靈敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。
2.堿性磷酸酶（AP）：是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時(shí)間。
在ELISA中應(yīng)用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結(jié)合物時(shí)得率較HRP低等原因，國(guó)內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮，可用熒光計(jì)檢測(cè)。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點(diǎn)是需要熒光計(jì)測(cè)定，而且如用固相載體直接作為測(cè)定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點(diǎn)是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒(méi)有內(nèi)源酶。
二、酶標(biāo)記抗體或抗原
酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）。抗原由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合，如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。醫(yī) 學(xué)教育網(wǎng)原創(chuàng)
1.戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過(guò)它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。戊二醛一步法操作簡(jiǎn)便、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法l0倍左右。
2.過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18%碳水化合物，過(guò)碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過(guò)碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成按摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過(guò)氧化物酶交聯(lián)zui有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。
按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中zui后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡(jiǎn)便，但效果不如用sephadexg-200凝膠過(guò)濾的好。
3.標(biāo)記抗體鑒定：通常采用棋盤滴定法進(jìn)行篩選，見(jiàn)第十九章。
三、固相載體
酶免疫技術(shù)的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。可作固相載體的物質(zhì)很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式，在測(cè)定過(guò)程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。
聚苯乙烯載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，zui后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過(guò)程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。zui常用的載體為微量反應(yīng)板，于ELISA測(cè)定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)或l2聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號(hào)的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng／ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測(cè)每孔溶液的吸光度。控制反應(yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10%.與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其他免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和一個(gè)典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較測(cè)定結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果判別zui大，這種載體就是這一ELISA測(cè)定的zui合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測(cè)定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測(cè)定形式將在本章“膜載體的酶免疫測(cè)定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時(shí)固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
四、免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（zui常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃過(guò)夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過(guò)低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面，zui后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過(guò)程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時(shí)間而不失去其免疫活性。
