一. 直接免疫熒光法測抗原
基本原理
將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少,相對使用標(biāo)記抗體用量偏大。
試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
熒光標(biāo)記的抗體溶液:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 進(jìn)行稀釋
緩沖甘油:分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制
搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實(shí)驗步驟
1. 滴加 0.01mol/L,pH7.4 的PBS于待檢標(biāo)本片上,10min后棄去,使標(biāo)本保持一定濕度。
2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液,使其*覆蓋標(biāo)本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一
30min
定時間(參考:30min)。
3. 取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 沖洗后,再按順序過 0.01mol/L,
pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不時振蕩。
4. 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度,一般可用“+”表示:
(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++
--++++)熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上,而各種對照顯示為(±)
或(-),即可判定為陽性。
注意事項
1. 對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋在 1:20-100 之
間,要自行摸索*梯度,建立的稀釋比例,抗體濃度過低,會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,
影響結(jié)果的觀察。
2. 染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時間可以從 10 min 到數(shù)
小時,一般 30 min 已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于 37℃可加強(qiáng)染色效果,
但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用 0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染
色過夜較 37℃30 min 效果好的多。
3. 為了保證熒光染色的正確性,試驗時需設(shè)置下述對照,以排除某些非特異性熒光染
色的干擾。
(1)標(biāo)本自發(fā)熒光對照:標(biāo)本加 1-2 滴 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS。
(2)特異性對照(抑制試驗):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗
體。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光, 待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽性染色。
4. 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過 3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察,隨著時間的延長,熒光強(qiáng)度會逐漸下降。
二. 間接免疫熒光法測抗原
基本原理
染色程序分為兩步,*步,用已知未標(biāo)記的抗體(待檢標(biāo)本)加到已知抗原(待檢標(biāo)本)
標(biāo)本上,在濕盒中 37℃保溫 30min,使抗原抗體充分結(jié)合,然后洗滌,除去未結(jié)合的抗體。
第二步,加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗 IgG、IgM 抗體(通常為熒光標(biāo)記的對應(yīng)二抗)。
如果*步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng),標(biāo)記的熒光標(biāo)記的二抗就會和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)
合,從而可鑒定被檢測抗原。
試劑與儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
緩沖甘油:分析純無熒光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液 1 份配制。
熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體:以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 進(jìn)行稀釋 。
搪瓷桶三只(內(nèi)有 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實(shí)驗步驟
1. 滴加 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 于未知抗原標(biāo)本片,10min 后棄去,使標(biāo)本片保持一定濕度。
2. 滴加以 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 適當(dāng)稀釋抗體,覆蓋未知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫 30min。
3. 取出玻片,置于玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 沖洗 1-2 次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 5min,不時振蕩 。
4. 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記二
抗
5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫 30min。
6. 重復(fù)操作 3。
7. 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。
8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。
注意事項
1. 熒光染色后一般在 1h 內(nèi)完成觀察,或于 4℃保存 4h,時間過長 ,會使熒光減弱。
2. 每次試驗時 ,需設(shè)置以下兩種對照:
(1) 陰性對照:陰性血清+熒光標(biāo)記物 (需有使用人員自行建立標(biāo)準(zhǔn))
(2) 熒光標(biāo)記物對照:PBS+熒光標(biāo)記物
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光, 待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為
特異性陽性染色。
3. 未知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。
4. 所滴加的抗體或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在未知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體
流失,從而造成非特異性熒光染色。
Storage: Store at –20 ºC for one year. Avoid repeated freeze/thaw cycles. The
lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater
than a year when kept at -20ºC. When reconstituted in sterile pH 7.4 0.01M PBS or diluent
of antibody, the antibody is stable for at least six weeks at 2-4 ºC.
Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in
human, therapeutic or diagnostic applications.