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ELISA原理酶聯(lián)免疫吸附測定

1.ELISA原理和類型

抗體或抗原可以吸附在合適的載體上，酶標記抗體或抗原相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標記的抗原抗體免疫復(fù)合物，在一定的底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使其水解，氧化或還原成為另一種帶色物質(zhì)。由于在一定的條件下，酶的降解底物和呈現(xiàn)色澤是成正比的，因此可以應(yīng)用分光光度計進行測定，從而計算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的含量。這就是Peter Perlmann 和Eva Engvall所建立的ELISA技術(shù)的原理。

按照所用固相載體的不同，ELISA又分為普通ELISA和Dot-ELISA.

招照抗體或抗原在固相載體上不同的吸附方法，又根據(jù)使用不同的抗體例如能與抗原直接反應(yīng)的抗體（通常稱為一抗），能與一抗起免疫結(jié)合反應(yīng)的標有酶的抗體（通常稱為酶標二抗），ELISA分化出多項不同的測定方法。

ELISA一般分為下述幾種類型：

• 直接法：首先將抗原吸附于載體表面，然后將酶標記抗體與該抗原反應(yīng)結(jié)合，形成酶標記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì)，進行光密度測定，算出抗原存在量。
• 間接法：首先將抗原吸附于載體表面，然后加抗血清，使特異性抗體（*抗體）與抗原結(jié)合，再加酶標記抗球蛋白（第二抗體，即抗*抗體的抗體），與*抗體結(jié)合，形成酶標記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì)，進行光密度測定，算出抗體存在量。
• 雙重抗體法：首先將抗體吸附于載體表面，形成抗體球蛋白致敏載體表面，然后加抗原溶液，使抗原與抗體結(jié)合，再加入酶標記的抗體球蛋白，與被致敏載體表面吸附的抗原結(jié)合，形成酶標記的免疫復(fù)合物，zui后加入底物產(chǎn)生有色物質(zhì)，進行光密度測定，算出抗原存在量。ELISA雙重抗體法也稱ELISA雙重抗體夾心法，該法能減弱非特異顏色的干擾，并且在測定時可不做空白對照。
• 酶標記抗原競爭法：首先將抗體吸附于載體表面，形成抗體球蛋白的致敏載體表面，然后加入以不同比例混合的抗原和酶標記的抗原溶液，與吸附在載體上的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成酶標記抗原與抗體的免疫復(fù)合物和非標記抗原與抗體的免疫復(fù)合物，zui后加入底物，通過酶的底物水解量(測定光密度而知)來確定未知溶液有無抗原及抗原量多少。

酶標記抗原競爭法利用混合的未標記抗原和酶標記抗原相互競爭抗體上的結(jié)合點，從而進行抗原的定量。未標記抗原的量越大，則酶標記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制。但是競爭法在實驗時比較復(fù)雜，有時在抗原混合液與相應(yīng)抗體孵育后，在測定游離抗原與抗體相結(jié)合抗原的活性以前，要先進行鹽析或有機溶劑沉淀或第二抗體沉淀等方法把兩種不同存在形態(tài)的抗原分開。并且在加入底物后，容易產(chǎn)生血清色的物質(zhì)。因此，每次測定時都需做空白對照。由于這些缺點，酶標記抗原競爭法使用不多。

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