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蔗糖合成酶（分解方向；SS-Ⅰ）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義

蔗糖是源（葉片等）光合產(chǎn)物向“庫(kù)"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是雙向反應(yīng)酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性對(duì)于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意義。

測(cè)定原理

SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG，采用3,5－二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量來(lái)反映酶活性的高低。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰

試劑的組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二： 液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×2 支，-20℃保存；臨用前每支加入 1.2mL 試劑二充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用； 試劑四：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL

提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定，（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

試劑名稱(chēng)（μL）測(cè)定管對(duì)照管

樣本1010

試劑三40

試劑一40

混勻，30℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，95℃水浴 10min 95℃水浴 5min 左右，冷卻至室溫

混勻，取 200μL  至微量石英比色皿或 96 孔板中，540nm 下測(cè)定各管吸光值。ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

SS-Ⅰ活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0012x - 0.0492；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y 為ΔA。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg  還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/g 鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=138.9×(ΔA+0.0492) ÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.05mL； V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0006x - 0.0492；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y 為ΔA。

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0006×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=277.8×(ΔA+0.0492) ÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg  還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/g 鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0006×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=277.8×(ΔA+0.0492) ÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.05mL； V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

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