貨號(hào):YJ1174 規(guī)格:100管/48樣
Ca++ Mg++-ATP 酶活性測定說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
Ca++ Mg++-ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。
測定原理:
根據(jù)Ca++ Mg++ -ATP 酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷,通過測定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性高低。
需自備的儀器及用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻待用;用不完的試劑 4℃保存一周;
試劑三:液體 2mL×1 瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入3mL蒸餾水, 4℃保存。
試劑五:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。
試劑六:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。
試劑七:液體25mL×1 瓶,室溫保存。
試劑八:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑八20倍稀釋,即取0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制:按 H2O: 試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
Ca++ Mg++-ATP酶活性測定注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
樣品酶液的制備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
操作步驟:
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 660nm,蒸餾水調(diào)零。
2、酶促反應(yīng)(在 EP 管中加入下列試劑)
| 對(duì)照管 | 測定管 |
試劑一(μL) | 65 | 45 |
試劑二(μL) | 60 | 60 |
試劑三(μL) |
| 20 |
樣本 (μL) |
| 100 |
混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴 10min | ||
試劑四(μL) | 25 | 25 |
樣本 (μL) | 100 |
|
混勻,8000g,25℃離心 10min,取上清液
3、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑)
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 對(duì)照管 | 測定管 |
0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL) |
| 20 |
|
|
上清液(μL) |
|
| 20 | 20 |
蒸餾水(μL) | 20 |
|
|
|
定磷試劑(μL) | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻,室溫放置30min,在660nm處,記錄各管吸光值。
注意事項(xiàng):
1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,本試劑盒100管只能測48份 Ca++ Mg++-ATP酶。
2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。避免磷污染是
檢測成敗的關(guān)鍵。
3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
Ca++ Mg++-ATPase 活力的計(jì)算:
1、血清(漿)Ca++ Mg++-ATPase 活力的計(jì)算:
定義:每小時(shí)每毫升血清(漿)中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h/mL)= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×(A 測定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Ca++ Mg++-ATPase 活力的計(jì)算:
(1)按蛋白濃度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(V樣×Cpr)÷T =7.5×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
定義:每小時(shí)每克組織中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應(yīng)總體積,0.25mL;V 樣:加入樣本體積,0.1mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/6 小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
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