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核仁組成區(qū)嗜銀-AGNOR染色實驗服務(wù)

一.核仁組成區(qū)嗜銀(AGNOR)染色簡介

核仁組成區(qū)(NORs)是染色體上的一個編碼核糖體RNA(rRNA)的片段，存在于DNA特異性環(huán)上，凸向核仁。在電鏡下，核仁組成區(qū)為在電子致密區(qū)中的境界不清的淺染區(qū)域。在石蠟切片上,在核仁中見到的每一個點(diǎn)狀反應(yīng)顆粒有可能代表多 個AgNOR位點(diǎn)。核仁組成區(qū)嗜銀蛋白染色主要特點(diǎn)是操作簡便、批量染色的較為經(jīng)濟(jì), AgNOR位點(diǎn)的數(shù)量增加與細(xì)胞增殖性增加有關(guān)，對于良惡性腫瘤的鑒別具有一定的意義。

二、試劑配制

1. AgNOR染色液

甲液:明膠2 g溶于雙蒸水至99 ml,在60°C使之*溶解，再加入純甲酸1 ml搖勻待用。

乙液: AgNO350 g溶解于雙蒸水中至100 ml, 4°C冰箱保存。

2. AgNOR工作液

取甲液10 ml,乙液20 ml臨用前混合。

三、染色步驟

1.切片脫蠟至水

2.雙蒸水洗2次

3.AgNOR工作液中(25°C) 浸染30分鐘(暗處進(jìn)行) (鏡下觀察)

4.脫水，透明，封固

5結(jié)果:油鏡觀察，細(xì)胞核及胞質(zhì)背暴為淡黃色，AgNOR呈棕黑色顆粒狀。

四、樣本說明

1、 石蠟切片

取材: 1.組織離體后需及時固定; 2.組織標(biāo)本不宜過大、過厚。

固定: 1.固定液: 10%福爾馬林(4%Paraformaldehyde) 或10%中性甲醛: 2.用量: -般固定液的量與組織體積比為

10:1~20:1; 3. 固定:適宜的固定時間，主要根據(jù)材料的大小松密程度及固定液的穿透速度而定。

保存:切片經(jīng)60°C烤片3-5小時后，可于常溫或4°C干燥保存。

2.冰凍切片

取材:取材后需立即置于超低溫冰箱或液氮中保存。

固定:樣本冰凍切片后，應(yīng)立即放入甲醇、acetone. 95%酒精、 4%Paraformaldehyde等固定液中固定。

保存:固定好的切片自然風(fēng)干，密封后置于-80°C. -20°C保存， 盡快用于后續(xù)實驗。

3.細(xì)胞塊石蠟切片

細(xì)胞量較多的樣品，可離心分離所需細(xì)胞，用中性甲醛固定后制作成瓊脂細(xì)胞塊，然后按照制作石蠟切片的操作流程進(jìn)行切

片。

4、細(xì)胞爬片

在孔板里做的細(xì)胞爬片，爬片取出后，用PBS洗滌2次(根據(jù)研究目的，PBS洗滌可選擇不做)。用4%Paraformaldehyde49C固定15分鐘，將表面液體吹干，置于-20°C保存。若在短時間內(nèi)即開展實驗,可在加固定液后，于4°C冰箱中放置一段時間。

5.細(xì)胞涂片細(xì)胞涂片常用的固定液有95%酒精(為常用)、酒精 Glacial acetic acid solution. Ethyl ether-酒精液和

Carney's液等。

五、注意事項

1.常用的固定液為中性甲醛和4%Paraformaldehyde, 能使大多數(shù)抗原保存良好，適用于免疫組織化學(xué)。

2.病理實驗切片好是防脫片，以免實驗過程中出現(xiàn)掉片。若客戶提供切片，應(yīng)告知切片有無防脫處理。

3.骨組織、皮膚組織或脂肪含量較高的樣本,實驗過程中有較高的掉片幾率。

4.客戶可提供組織塊(以10%福爾馬林、4%Paraformaldehyde或10%中性甲醛固定， 如組織塊極小請事先說明) . 蠟塊

或切片(使用免疫組化切片，以避免實驗過程中掉片)

5.待檢測蛋白的種屬、實驗分組情況及實驗背景資料、其他具體要求等需事先說明。

6.若客戶提供骨組織或鈣化程度較高的組織進(jìn)行實驗，需進(jìn)行脫鈣處理。

7.浸泡在固定液中的組織樣本，在運(yùn)輸中容器需密封，防止破碎、滲漏。

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